Deel 1 - Selectie van het gen: DNA, genen en eiwitten
Veel mensen hebben een mening over genetische modificatie en ze weten ook wel wat ermee bedoeld wordt: ‘het veranderen van de genen van organismen zoals planten, dieren, bacteriën, schimmels en virussen'. Alleen wat de meeste mensen niet weten: hoe doe je dat dan?
Dat hangt grotendeels van twee dingen af, ten eerste: welk organisme wil je aanpassen en ten tweede, wil je een gen inbrengen of uitschakelen? In mijn onderzoek houd ik me vooral bezig met genetische modificatie van planten en mossen om de functies en werking van bepaalde eiwitten te kunnen begrijpen. En hoewel deze organismen ontzettend op elkaar lijken, zijn de technieken die we gebruiken om mutanten (organismen die genetisch gemodificeerd zijn) te maken heel verschillend tussen deze twee soorten. Vandaag beginnen we met planten.
Meestal beginnen we met het wildtype, het wildtype is het plantje of het mosje dat we in de natuur terugvinden. Vervolgens kunnen we ervoor kiezen om hier een gen aan toe te voegen of om een gen uit te schakelen, onze toekomstige mutant. Op dit moment ben ik bezig om een gen uit mosjes toe te voegen aan een plant, Arabidopsis thaliana (A. thaliana, in het Nederlands zandraket), een bekend modelorganisme voor het onderzoek in planten. Het gen dat ik toe wil voegen is lhcsr. Het uiteindelijke doel is om beter te begrijpen hoe LHCSR (dat de bescherming van planten tegen te veel licht regelt) precies werkt en dat kunnen we in dit geval makkelijker bestuderen in A. thaliana dan in mos. Voor het geval je dacht, wat is het verschil tussen lhcsr en LHCSR: met LHCSR bedoelen we het eiwit en met lhcsr het gen. Verwarrend? Ja best wel, maar de genetici hakken je hoofd eraf als je het fout doet.
We willen dus het lhcsr-gen van mossen bij A. thaliana inbrengen. Als eerste hebben we daarvoor nodig: het losse gen zelf. Gelukkig is het complete genoom van deze mosjes bekend en kunnen we het gen opzoeken en dan vinden we dat het lhcsr-gen 1010 basenparen of nucleotiden lang is. Dat betekent dat er 1010 A’tjes, T’tjes, G’tjes en C’tjes (de vier verschillende nucleotiden) in een specifieke volgorde achter elkaar staan. De specifieke volgorde is uniek voor een gen en elke combinatie van 3 nucleotiden geeft aan welk aminozuur (de bouwstenen van een eiwit) er op die plek gemaakt moet worden. Bijvoorbeeld de code ‘A T G’ codeert voor het aminozuur methionine. Deze methionine is de start van een eiwit en wordt gevolgd door alle andere aminozuren die gecodeerd worden door de rest van het gen. In het geval van lhcsr wordt ATG gevolgd door GCC, wat weer codeert voor een alanine. Een eiwit is dus een keten van aminozuren die verantwoordelijk is voor het uitvoeren van de actie waar het gen voor bedoeld is, zoals het LHCSR-eiwit de bescherming van de plant tegen te veel licht regelt.
Maar er is een probleem!! Er zijn 1010 nucleotiden en als er elke keer 3 nucleotiden voor 1 aminozuur coderen om het uiteindelijke eiwit te maken, dan kom je niet uit!! Dat klopt, dat komt omdat er nog een stukje in het gen zit, wat uiteindelijk nooit in het eiwit terecht zal komen. Dit komt doordat het organisme eerst een tussenvorm van het gen (messenger RNA, mRNA) maakt. Dit is een kopie van het gen waar alleen de stukken op staan die nodig zijn voor het coderen van het eiwit.
Dit zou je kunnen vergelijken met het bouwen van een auto. Het hele boek met instructies om een auto te bouwen is het genoom (al het DNA wat een organisme heeft). Een monteur is verantwoordelijk voor het in elkaar zetten van de motor (het eiwit). Hij pakt het hele boek erbij en gebruikt hieruit het stuk wat gaat over de motor. Dat hele stuk is eigenlijk een beetje te lang omdat er ook een extra stukje uitleg staat over bijvoorbeeld een andere versie van de motor. Dus hij gebruikt alleen het stuk over zijn versie van de motor (het mRNA) en hij gooit het tussenstuk wat niet nodig is weg.
Halen we dit tussenstuk uit het gen, dan houden we 735 nucleotiden over en dat is perfect deelbaar door 3. We weten dus precies hoe ons gen en mRNA eruit zien en hoe ons uiteindelijke eiwit (motor) opgebouwd moet zijn. De vraag is echter, weet onze monteur in A. thaliana ook welk tussenstuk niet nuttig is voor het uiteindelijke eiwit en als hij dat al weet, werkt het eiwit überhaupt wel in A. thaliana? Dat weten we van tevoren niet, dus om een deel van het risico te vermijden, kopiëren we het gen van de mosjes, maar halen het onnodige tussenstuk er alvast uit (lief toch?). We geven onze plant dus alleen het hoofdstuk over de motor zonder de extra uitleg. Zo zal de monteur in de plant het hoofdstuk meteen goed lezen en de motor hopelijk in elkaar zetten. Of hij dan ook werkt is nog steeds de vraag.
Het is niet gek als dit allemaal nog even moet bezinken, dus we nemen nu pauze. In het volgende deel gaan we lekker knippen en plakken, mijn favoriete onderdeel, want dan mogen we gaan puzzelen met het gen. Mocht je nog vragen hebben, leave a comment ;).
Kan het verwijderen van het intron de functionaliteit van het organisme beïnvloeden? Het overgebleven RNA dat ooit de intron was kan ook een cellulaire functie hebben als ik me niet vergis.
De intronen kunnen verschillende functies hebben. Ze hebben soms een regulerende functie en het intron verwijderen kan betekenen dat je meer of minder van mRNA en uiteindelijk ook van je eiwit krijgt. Een andere mogelijkheid is dat 1 gen meerdere intronen heeft, door te spelen met welke intronen wel en niet inbegrepen worden in het mRNA kan een organisme verschillende eiwitten maken van slechts 1 gen.
Het intron heeft dus ook een functie, al is het vaak niet helemaal duidelijk wat. In dit geval heeft het waarschijnlijk invloed op de expressie.
En de intron wordt verwijderd omdat de preMRNA cleavage sites tussen mos en arabidopsis verschillen?
We verwijderen het intron inderdaad omdat we niet zeker weten of het pre-mRNA hetzelfde gespliced wordt. In principe werk je altijd met de coding sequence (CDS) op het moment dat je van het ene organisme naar het andere organisme gaat.
Ik ben wel benieuwd wat je uiteindelijk verwacht dat de zandraket gaat doen als je deze hebt gemodificeerd. Zal deze sneller of langzamer gaan groeien omdat deze beter/slechter is beschermd tegen te veel licht? Zal de plant "verbranden" als je hem in te volle zon zet? Ben nieuwsgierig wat voor experiment je daarvoor gaat gebruiken.
En dankjewel voor de heldere uitleg! 🙂
In eerste instantie was het doel om LHCSR1 beter te kunnen bestuderen. We zetten het in Arabidopsis omdat deze transformatie over het algemeen makkelijker en sneller is dan in mosjes, daarbij zijn er al heel veel verschillende mutanten beschikbaar van Arabidopsis. Om een voorbeeld te noemen die wij gebruikt hebben: een mutant die helemaal geen bescherming heeft tegen te hoge licht concentraties. We zijn erachter gekomen dat Arabidopsis met LHCSR1 slechter beschermd is tegen teveel licht, dit komt omdat het LHCSR1 niet zo goed werkt in Arabidopsis als in mosjes. Of deze ook daadwerkelijker slechter groeit dan het wildtype dat weten we nog niet.
We hebben wel gekeken waardoor het zou kunnen komen dat LHCSR1 minder goed werkt en we weten nu dat dit voor een deel komt doordat bepaalde carotenen in minder hoge concentraties voorkomen in Arabidopsis dan in mosjes. Dit weten we doordat we verschillende mutanten hebben getransformeerd die allemaal 1 specifiek caroteen missen.
We kunnen niet testen of de planten beter of slechter groeien in de 'volle zon' omdat het een genetisch gemodificeerd organisme is. We groeien de planten alleen in speciaal ontworpen groeikamers (tenzij je in Amerika of China woont). Op dit moment probeer ik een systeem te bouwen om de planten in hoge lichtconcentraties te kunnen laten groeien, dat klinkt makkelijker dan het is, want op een zomerse dag is er ontzetted veel licht. We zouden de planten dan laten groeien in afwisselende lichtconcentraties, bijvoorbeeld 5 minuten veel licht en 5 minuten minder licht. Dit is belangrijk omdat dat het beschermingssysteem waar wij onderzoek naar doen op hele korte termijnen werkt (van enkele seconden tot een paar minuten). Als het licht langer aan zou staan krijg je te maken met andere aanpassingen die in dit geval minder relevant zijn. Daarbij simuleert dit systeem een iets 'natuurlijkere' situatie zoals de schaduw van een wolk of het veranderen van het bladerdek door de wind.